簡(jiǎn)介

深加工食品基因組提取試劑盒適合于從各種食品樣品中快速提取高純度的植物 DNA。本 試劑盒采用硅膠柱純化技術(shù)和經(jīng)典的 CTAB/氯仿抽提技術(shù)，獲得的核酸可直接用于 PCR、 Sorthern 雜交/Northern 雜交，以及 LAMP 等下游實(shí)驗(yàn)。本試劑盒提供兩個(gè)流程，請(qǐng)根據(jù)下游 應(yīng)用和樣品特點(diǎn)選擇合適的流程。

原理

本試劑盒采用的硅膠柱以高結(jié)合力的玻璃纖維濾膜為基質(zhì)。濾膜在高濃度離子化劑(如 鹽酸胍或異硫氰酸胍)條件下，可通過(guò)氫鍵和靜電等物理化學(xué)作用吸附核酸，而蛋白質(zhì)和其 它雜質(zhì)則不被吸附而去除。吸附了核酸的濾膜經(jīng)洗滌去除殘留的蛋白質(zhì)和鹽，最后可以用DEPC 處理水洗脫濾膜上吸附的核酸，得到的核酸純度高，可直接用于各種下游實(shí)驗(yàn)。 本試劑盒基于硅膠柱純化方式。樣品在裂解液中裂解，DNA 釋放到裂解液中。用氯仿 抽提去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到上清液并加入結(jié)合液，轉(zhuǎn)移到柱子中過(guò)濾，DNA 被吸 附在硅膠柱的膜上，而蛋白質(zhì)則不被吸附而去除。后經(jīng)洗滌液洗滌去除鹽分，最后 DNA 被 無(wú)核酸酶洗脫液洗脫。

產(chǎn)品組成

Buffer GW2 在初次使用前加入 80mL無(wú)水乙醇，并于室溫保存。

Proteinase K 干粉初次使用前加入 2.5mL Protease Dissolve Buffer（終濃度為20mg/mL）， 顛倒混勻使蛋白酶 K 充分溶解，于-20℃保存。

保質(zhì)期

深加工食品DNA 提取試劑盒除Proteinase K 外，可在室溫下(15-25℃)干燥保存 18 個(gè)月。 Proteinase K 干粉室溫運(yùn)輸，收到產(chǎn)品保存于 2-8℃。Buffer PTL 和 Buffer GXP 在低溫貯藏中 可能會(huì)有沉淀析出，60℃水浴 30 分鐘使之溶解。

方案 1. 食品 DNA 小量提取(200mg)

該方案適合于從 200mg 食品樣品中提取總 DNA。

準(zhǔn)備材料和工具

無(wú)水乙醇(96-100%)

氯仿 ? 1.5mL離心管

2mL 離心管

小型離心機(jī)(≤14,000 xg)

65℃水浴鍋或金屬浴

操作流程

1. 用合適的方法勻漿食品樣品，轉(zhuǎn)移 200mg 勻漿好的樣品至 2mL 離心管中。

2. 加入 1mLBuffer PTL 和 10µL Proteinase K(20mg/ml)至樣品中，渦旋讓樣品充分混勻。65oC 振蕩消化 30~60 分鐘。 （若樣品含有較多淀粉類(lèi)物質(zhì)，加倍Buffer PTL 用量以確保樣品*被 Buffer PTL 浸泡。）

3. 冰浴 3~5 分鐘讓樣品恢復(fù)至室溫，14,000xg 離心 5 分鐘。

4. 在 2mL離心管中預(yù)先加入 0.6mL 氯仿。 5. 小心轉(zhuǎn)移上清液（0.6~0.7mL）至裝有氯仿的離心管中。渦旋混勻 15 秒。 （若上清液體積小于 500µL，可多處理幾管樣品，在這一步將上清液合并在一起，混勻后再轉(zhuǎn)移 0.5~0.7mL至氯仿中。）

6. 14,000xg 離心 10 分鐘。

7. 小心轉(zhuǎn)移 500µL 上清液至新的離心管中。加入 500µL Buffer GXP 至上清液中，渦旋混勻 15 秒。

8. [可選，若回收小于 100bp 的 DNA 片段] 加 500µL 無(wú)水乙醇至混合液中，渦旋混勻 15 秒。 （若樣品富含色素和多糖類(lèi)物質(zhì)，加入乙醇可能會(huì)引起色素/多糖的沉淀而影響核酸的純度。）

9. 把管 A 裝在管 B 中。轉(zhuǎn)移混合液(700µL)至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

10. (若混合液超過(guò) 700µL) 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。把剩余混合液轉(zhuǎn)移 至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

11. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。加入 600µL Buffer GW2(已用無(wú)水乙醇稀釋) 至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。Buffer GW2 在使用之前須用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋。 按瓶子標(biāo)簽指示進(jìn)行稀釋。 12. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。加入 600µL Buffer GW2(已用無(wú)水乙醇稀釋) 至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

13. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。13,000xg 離心 3 分鐘去除管 A 中殘留的乙 醇。

14. 將管 A 轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL離心管中。加入 50µL Elution Buffer 至管 A 的膜中央。室溫 靜置 3 分鐘。13,000xg 離心 1 分鐘。

15. 丟棄 DNA 結(jié)合柱，把 DNA 保存于-20℃。

方案 2. 食品 DNA 提取(2g)

該方案適合于從 2g 食品樣品中提取總 DNA。

需要準(zhǔn)備的材料和工具

無(wú)水乙醇(96-100%)

氯仿 ? 1.5mL 離心管

2mL 離心管

50mL離心管

大型離心機(jī)(3,000xg)

小型離心機(jī)(≤14,000xg)

65℃水浴鍋或金屬浴

操作流程

1. 用合適的方法勻漿食品樣品，轉(zhuǎn)移 2g 勻漿好的食品樣品至 50mL 離心管中。

2. 加入10mL Buffer PTL和40µL Proteinase K(20mg/mL)至樣品中，渦旋讓樣品充分混勻。65oC 振蕩消化 30~60 分鐘。 （若樣品含有較多淀粉類(lèi)物質(zhì)，加倍 Buffer PTL 用量以確保樣品*被Buffer PTL 浸泡。）

3. 冰上放置 3~5 分鐘。3,000~4,000xg 離心 5 分鐘。

4. 在 2mL 離心管中預(yù)先加入 0.8mL 氯仿。

5. 轉(zhuǎn)移 0.75~0.8mL上清液至裝有氯仿的離心管中。渦旋混勻 15 秒，14,000xg 離心 15 分鐘。

6. 小心轉(zhuǎn)移 700µL 上清液至新的離心管中。加入 700µL Buffer GXP 至上清液中，渦旋混勻 15 秒。

7. [可選，若回收小于 100bp 的 DNA 片段] 加入 700µL 無(wú)水乙醇至混合液中，渦旋混勻 15 秒。 （若樣品富含色素和多糖類(lèi)物質(zhì)，加入乙醇可能會(huì)引起色素/多糖的沉淀而影響核酸的純度。）

8. 把管 A 裝在管 B 中。轉(zhuǎn)移混合液(700µL)至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

9. (若混合液超過(guò) 700µL) 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。把剩余混合液轉(zhuǎn)移至 管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

10. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。加入 600µL Buffer GW2(已用無(wú)水乙醇稀釋) 至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

11. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。加入 600µL Buffer GW2(已用無(wú)水乙醇稀釋) 至管 A 中。8,000xg 離心 30~60 秒。

12. 倒棄管 B 中的濾液，把管 A 裝回管 B 中。13,000xg 離心 3 分鐘去除管 A 中殘留的乙醇。

13. 將管 A 轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL 離心管中。加入 50µL Elution Buffer 至管 A 的膜中央。室溫 靜置 3 分鐘。13,000xg 離心 1 分鐘。

14. 丟棄 DNA 結(jié)合柱，把 DNA 保存于-20℃。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

該列表可能有利于您解決在提取過(guò)程中所碰到的問(wèn)題。若您對(duì)試劑盒存在疑問(wèn)或有良好的建 議，又或者您在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中碰到問(wèn)題，都請(qǐng)您聯(lián)系我們。我們將竭盡所能為您排擾解難。

現(xiàn) 象 原 因 解 決 方 法 柱子堵塞 轉(zhuǎn)移上清液時(shí)帶有太 多沉淀 在下一次提取過(guò)程中，轉(zhuǎn)移上清液時(shí)不要吸到沉 淀物。若吸到沉淀物，可把上清液再離心一次。 裂解液非常粘稠 某些食品樣品中含有豐富的粘液和高分子多糖， 會(huì)讓裂解液變得非常粘稠。減少樣品用量或加入 Buffer PTL 的用量。 離心速度太低 提高離心速度或延長(zhǎng)離心時(shí)間。 加入氯仿后，混勻不 夠 在下次制備時(shí)，加入氯仿時(shí)一定要?jiǎng)×艺袷幓靹颉?DNA 產(chǎn)量低 樣品勻漿不充分 充分研磨樣品，將樣品研磨成細(xì)小的粉末狀。 樣品裂解不充分 適當(dāng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間，加入 Buffer PTL 后，讓樣品 充分分散。 Proteinase K 用量不 足 對(duì)肉類(lèi)源性的食品，加大蛋白酶用量以提高消化 效果 結(jié)合條件不正確 計(jì)算上清液體積，加入適量的 Buffer GXP 和乙 醇。 洗脫效率不夠 洗脫時(shí) Elution Buffer 預(yù)熱至 65℃，并加到膜中 央，室溫放置 3 分鐘。 Buffer GW2 中乙醇沒(méi) 有加入或加入量不夠 按說(shuō)明書(shū)或瓶子標(biāo)簽所示，加入正確的乙醇。 柱子沒(méi)有空甩 柱子必須空甩 2-3 分鐘以去除膜上殘留的乙醇。 若以上的解答還是無(wú)法解決您的問(wèn)題，請(qǐng)您聯(lián)系我們。