糜蛋白酶（Chymotrypsin）試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

糜蛋白酶，又稱胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)。糜蛋白酶的功能與胰蛋白酶相似，但是具有分解能力強、毒性低和不良反應(yīng)小等優(yōu)點。臨床上糜蛋白酶用于痰液稀化，對膿性和非膿性痰液均有效；也用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合，如白內(nèi)障摘除。

測定原理：

糜蛋白酶催化ATEE水解，產(chǎn)物在237 nm有特征光吸收；通過測定237 nm 光吸收增加速率，來計算糜蛋白酶活性。

自備儀器和用品：

臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入20 mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到237 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中保溫30min。

3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL試劑一，200μL試劑二，混勻于237nm測定4min內(nèi)吸光值變化，記為△A空白管。（從吸光值穩(wěn)定增加開始計時）

4. 測定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL粗酶液，200μL試劑二，混勻于237nm測定4min內(nèi)吸光值變化，記為△A測定管。（從吸光值穩(wěn)定增加開始計時）

注意：空白管只需要測定一次。

糜蛋白酶活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。

糜蛋白酶（U/g 鮮重）=(△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷W

W：樣品質(zhì)量（g）；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10^-2 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL；V反總：反應(yīng)總體積，220μL=0.22mL； T：反應(yīng)時間（min），4min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。

糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V1)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加1為一個酶活單位。

糜蛋白酶（U/g 鮮重）=(△A測定管－△A空白管) ×V反總÷(W×V1÷V2)÷T

=2.75×(△A測定管－△A空白管)÷W

W：樣品質(zhì)量（g）；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10^-2 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL；V反總：反應(yīng)總體積，220μL=0.22mL； T：反應(yīng)時間（min），4min。

注意事項：

臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。