硝酸還原酶（Nitrate Reductase，NR）活性測(cè)定試劑盒說明書

                                   微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

NR（ EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導(dǎo)酶，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。

測(cè)定原理：

NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H^＋→ NO2ˉ +NAD^＋ +H ₂ O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對(duì)–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，-20℃保存。

試劑二：液體5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；

試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，-20℃保存。

誘導(dǎo)劑應(yīng)用液的配制：用時(shí)將誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液稀釋10倍，即取10mL誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液加90mL蒸餾水，充分混勻。

0.1umol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液的配制：用時(shí)將試劑五稀釋100倍，即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水，充分混勻。

樣本前處理：

動(dòng)植物組織樣品的前處理:

（1）取適量誘導(dǎo)劑于燒杯中，將新鮮標(biāo)本洗凈，濾紙吸干，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中（淹沒即可），浸泡2h，取出樣本，濾紙吸干。

（2）按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

注意：

1、   建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本。

2、   一般不要誘導(dǎo)處理，預(yù)測(cè)定結(jié)果沒有活性（A測(cè)定≤A對(duì)照管）則需要誘導(dǎo)處理。

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

    混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）反應(yīng)30min

混勻，25℃室溫顯色20min，540nm處比色

注意：1、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)一次，每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

     2、誘導(dǎo)處理后的樣本對(duì)照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。

NR活性計(jì)算：

（1）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每g鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR活力單位。

NR（μmol/h/g 鮮重）= (C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每小時(shí)每mg組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè) NR活力單位。

NR（μmol/h/mg prot）=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V1)×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A測(cè)定管-A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1μmol/mL；V1：加入樣本體積：0.02mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。