NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說(shuō)明書

                                 微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。

測(cè)定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一、提取液100 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑二、液體20 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑三、粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

3、測(cè)定前將檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將酶液用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘

以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NADP-MDH活力單位的計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=12860×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。