蔗糖酶（sucrase）試劑盒說明書

                                       微量法100管/48樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

蔗糖酶（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的關鍵酶之一，能夠水解蔗糖變成相應的單糖而被機體吸收。

測定原理：

本試劑盒采用3.5－二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化產(chǎn)生的還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應液的顏色深度成正比。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。

所需的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、沸水浴、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支 ，4℃保存，用時加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體3mL×1瓶，常溫保存；

樣品測定的準備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至520nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

置于25℃準確水浴10min

混勻， 95℃水浴5min左右（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫

混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中測定各管520nm吸光值，ΔA=A測定-A對照，每個測定管需設一個對照管。

蔗糖酶活力計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y = 0.1296x -0.12；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(V1×Cpr)÷T=771×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘催化水解1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=771×(ΔA +0.12) ÷W。

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，0.03mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0648x -0.12；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1542×(ΔA +0.12)÷Cpr。

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化水解1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鮮重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=1543×(ΔA +0.12) ÷W。

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，0.03mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，10min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。