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谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/13      點(diǎn)擊次數(shù):429

谷胱甘肽還原酶GR活性測(cè)定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶,是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一(通常昆蟲中GRTrxR取代)。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH,有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用,此外GR還參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑。

 

測(cè)定原理:

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH,同時(shí)NADPH脫氫生成NADP+;NADPH340 nm有特征吸收峰,相反NADP+在該波長無吸收峰;通過測(cè)定340 nm吸光度下降速率來測(cè)定NADPH脫氫速率,從而計(jì)算GR活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體120mL×1瓶,4保存。

試劑二:粉劑×2支,-20保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水,混勻。

試劑三:粉劑×2,-20保存。臨用前加入0.6mL蒸餾水,混勻。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4離心15min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g4,離心15min,取上清置于冰上待測(cè)。

 

3.        血清等液體:直接測(cè)定。

 

操作步驟:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于25℃(普通物質(zhì))或者37℃(哺乳動(dòng)物)中預(yù)熱30min。

3. 測(cè)定管:取微量石英比色皿或96孔板,依次加入10μL試劑三,20μL試劑二,150μL試劑一,20μL上清液,混勻,340nm迅速測(cè)定初始吸光度和180 s吸光度,記為A測(cè)1A測(cè)2,A測(cè)定管= A測(cè)1A測(cè)2。

 

意:

 

1.加完上清液后必須迅速混勻測(cè)定,保證準(zhǔn)確測(cè)出初始反應(yīng)速度;

2.當(dāng)出現(xiàn)初始180s內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時(shí),可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間,選取相對(duì)穩(wěn)定的時(shí)間段內(nèi)吸光值變化值;

3.當(dāng)所測(cè)△A測(cè)定管的值在零點(diǎn)附近徘徊時(shí),可能原因:(1)樣本GR酶活性低,建議濃縮樣本后再進(jìn)行測(cè)定;(2)樣本GR酶活性過高,吸光值變化區(qū)間過小無法準(zhǔn)確測(cè)出,建議樣本稀釋2~5倍后再進(jìn)行測(cè)定)

 

計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V]÷T

= 536×A測(cè)定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V÷V樣總)÷T

= 536×A測(cè)定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T           

= 536×A測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位

GR酶活(nmol/min/mL)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V÷T

= 536×A測(cè)定管

εNADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L1061 mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL =2×10-2 mLV樣總:提取液體積,1 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,3 min。

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位

GR酶活(nmol/min/mg prot)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V]÷T

= 1072×A測(cè)定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每克樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(W×V÷V樣總)÷T

= 1072×A測(cè)定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位

GR酶活(nmol/min/104 cell)= [ A測(cè)定管÷ε÷d×V反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T           

=1072×A測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:在一定溫度中,pH8.0條件下,每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化1個(gè)酶活單位。

GR酶活(nmol/min/mL)= [ (A測(cè)定管-A空白管)÷ε÷d×V反總×109]÷×V÷T

=1072×A測(cè)定管

εNADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cmV反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4

 

L1061 mol=1×106μmol; Cpr上清液蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL =2×10-2 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;V樣總:提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,3 min。

 

注意事項(xiàng):

1)樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力,勻漿液避免反復(fù)凍融;

2)試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用,配制完后,置于冰上,未使用完的4℃保存,三天內(nèi)使用完。

3測(cè)定前須先用12個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋25倍。

4)細(xì)胞中GR活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300-500萬之間,細(xì)胞中GR的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。


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