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脫氫酶(dehydrogenase, DHA)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/23      點(diǎn)擊次數(shù):371

脫氫酶(dehydrogenase, DHA)試劑盒說(shuō)明書

微量法100/96


   意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶,催化底物通過細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化,釋放的能量供機(jī)體使用,是生物體取得能量的一種方式。

 

測(cè)定原理:

在細(xì)胞呼吸過程中,氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在脫氫酶作用下接受氫以后,被還原為三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF呈現(xiàn)紅色,于485nm測(cè)定其吸光值,即得脫氫酶活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)儀器及用品:

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇(不允許快遞,請(qǐng)用戶自備)。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存

試劑一:粉劑×1瓶,使用前加10mL試劑二溶解,4℃避光保存(盡量現(xiàn)配現(xiàn)用)。

試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:甲醇,自備。

 

樣品處理:

1.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

2.        組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后8000g,4℃,離心20min。

3.        液體:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟和操作表:

 


空白管

測(cè)定管

樣品(μL


100

蒸餾水(μL

100


試劑一(μL


100

試劑二(μL

100


充分混勻,37培養(yǎng)24h

試劑三(μL

900

900

振蕩1h,8000g,25,離心5min,取200μL上清于微量石英比色皿/96孔板,測(cè)定A485,△A=A測(cè)定-A空白管。空白管只要做一管。

 

脫氫酶活力計(jì)算:

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0422x - 0.0312;R2 = 0.9988;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min / mg prot=(△A+0.0312÷ 0.0422×V反總÷Cpr×V樣)÷T= 0.181×(△A+0.0312÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min /g 鮮重)=(△A+0.0312÷ 0.0422×V反總÷W×V÷V樣總)÷T= 0.181×(△A+0.0312÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min /mL=(△A+0.0312÷ 0.0422×V反總÷V÷T= 0.181×(△A+0.0312

 

V反總:反應(yīng)總體積,1.1mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;T:培養(yǎng)時(shí)間,1d=1440min;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL。

 

b. 96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0211x - 0.0312;R2 = 0.9988;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min / mg prot=(△A+0.0312÷ 0.0211×V反總÷Cpr×V樣)÷T= 0.362×(△A+0.0312÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min /g 鮮重)=(△A+0.0312÷ 0.0211×V反總÷W×V÷V樣總)÷T= 0.362×(△A+0.0312÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義:在37℃時(shí),每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHAμg/ min /mL=(△A+0.0312÷ 0.0211×V反總÷V÷T= 0.362×(△A+0.0312

 

V反總:反應(yīng)總體積,1.1mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL;T:培養(yǎng)時(shí)間,1d=1440min;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

 

注意事項(xiàng):

配制好的試劑一避光保存于4℃,最好在一周內(nèi)使用,若出現(xiàn)紅色,則不能使用。


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