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檸檬酸(citric acid, CA)含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/23      點擊次數(shù):381

檸檬酸(citric acid, CA)含量測定試劑盒說明書

微量法100管/96樣


注   意 :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

CA是生物體內(nèi)常見的有機酸,是重要的食品風味物質(zhì)。此外,CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。

測定原理:

酸性條件下,檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+,在545nm處有特征吸收峰;通過測定545nm吸光值的增加,即可計算出樣品中檸檬酸含量。


自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。


試劑組成和配置:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體×1管,-20℃保存。

試劑四:粉劑×1管,室溫保存。臨用前配制,加入2mL試劑一,充分溶解。

試劑五:液體×1管,4℃避光保存。

標準品:液體×1管,250μmol/L檸檬酸標準液,4℃保存。


樣品中檸檬酸提?。?/p>

1.        液體樣品中檸檬酸提?。喝?.1mL液體加試劑一0.9mL,充分混勻,11000g, 4℃離心10min,取上清液,待測。

2.        組織中檸檬酸提取:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。

3.        線粒體中檸檬酸提取:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿,600g/min,4℃離心5min;取上清至另一EP管中,11000g,4℃離心10min,棄上清(此上清液可用于細胞質(zhì)CA含量測定);向沉淀中加試劑二200μl,以及試劑三2μl,充分懸浮溶解,11000g,4℃離心10min,取上清液,待測。

4.        細菌、真菌中:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。


測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到545 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL蒸餾水,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A空白管。


4. 標準管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL標準液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A標準管。

5. 測定管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL上清液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,充分混勻后室溫靜置30min,于545nm測定吸光度,記為A測定管。

注意:空白管和標準管只需測定一次。


計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.        按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量(nmol/L)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數(shù):(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。

2.        按組織質(zhì)量計算

檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質(zhì)量,g。

3.        按蛋白含量計算

檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)含量,mg/mL。

4.        按細胞數(shù)量計算

檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷細胞數(shù)量

= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數(shù)量

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;


b.使用96孔板測定的計算公式如下

3.        按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量(nmol/L)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

C標準液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數(shù):(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。

4.        按組織質(zhì)量計算

檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷W

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質(zhì)量,g。

5.        按蛋白含量計算

檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管) ÷Cpr

C標準液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)含量,mg/mL。

6.        按細胞數(shù)量計算


檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標準液×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)]×V總÷細胞數(shù)量

= 250×(A測定管-A空白管) ÷(A標準管-A空白管) ÷細胞數(shù)量

C標準液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;


注意事項:

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行。

2. 試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用,配置好的一周內(nèi)使用完;

3. 試劑五為易致癌物質(zhì),實驗過程中,需佩戴手套,避免試劑五濺到皮膚上。

4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定,如需測定蛋白含量,需另取組織,使用本公司BCA試劑盒進行測定。



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