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      3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 試劑盒說明書

      發(fā)布時間:2023/10/25      點擊次數(shù):408

      3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinasePGK

      試劑盒說明書

                                                          微量法100T/96S


          意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

      測定意義:

      3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶,廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi),催化13-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>3-磷酸甘油酸,產(chǎn)生1分子ATP,具有影響DNA復(fù)制和修補及刺激病毒RNA合成等生物學(xué)功能,廣泛應(yīng)用于藥物靶標設(shè)計。

       

      測定原理:

      3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP產(chǎn)生1,3-二磷酸甘油酸和ADP,1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH作用下產(chǎn)生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸,340nm處的吸光度變化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

       

      自備實驗用品及儀器:

      天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板。

       

      試劑組成和配制:

      提取液:液體100mL×2瓶,4℃保存。 

      試劑一:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

      試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

      試劑三:粉劑×1支,-20℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

      試劑四:粉劑×1支,-20℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

      試劑五:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加4 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

       

      酶液提?。?/span>

      PGK酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4500g離心5min,取上清測定。

      ②胞漿和葉綠體PGK酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)1510的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液),冰浴勻漿后于4500g離心5min,棄沉淀,取上清在4,8000g離心10min,取上清用于測定胞漿PGK酶活性,取沉淀加1mL提取液,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時間1min),然后4,500g離心5min,取上清測定葉綠體中PGK酶活性。

      建議測定總PGK酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的PGK,則按照步驟②提取粗酶液。

       

      測定操作:

      1.        分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

      2.        微量石英比色皿/96孔板,依次加入100μL試劑一,20μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,40μL試劑五,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm10s的吸光值A1310s的吸光值A2,△A=A1-A2

       

       

      計算公式

      a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

      1)按照樣本蛋白濃度計算

      酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

      PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

      2)按照樣本質(zhì)量計算

      酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

      PGKnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

      V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

       

      b.       96孔板測定的計算公式如下

      1)按照樣本蛋白濃度計算

      酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

      PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

      2)按照樣本質(zhì)量計算

      酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

      PGKnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

      V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g


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