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丙酮酸羧化酶(PC)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/26      點擊次數(shù):413

丙酮酸羧化酶PC)試劑盒說明書

                                     微量法100/96


    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中,催化丙酮酸、ATPCO2和水生成草酰乙酸、ADPPi,是糖異生過程的第一個限速酶,在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。

 

測定原理:

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADPPi,蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm下測定NADH氧化速率,即可反映PC活性。

 

需自備的儀器和用品:

分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體18 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:液體13uL×1支,4保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;

試劑四:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

1、   稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞,加入1mL提取液,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g,4離心5min。

3、   棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4離心10min

4、   上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的PC(此步可選做)。

5、   在步驟④的沉淀中加入1mL提取液,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體PC活性測定。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;置于37℃(哺乳動物)25(其它物種)預(yù)熱5分鐘;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑四的配制:在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1 2min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

 

注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.5,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定,使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

PC活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=3.215×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PCnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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