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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/26      點擊次數(shù):415

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK)試劑盒說明書

                                          微量法100/96

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

PEPCKEC 4.1.1.32廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中,催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸,是調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵酶。

 

測定原理:

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。

 

需自備的儀器和用品:

分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體18 mL×1瓶, 4保存;

試劑二:液體16.5uL×1支,4保存;

試劑三:粉劑×1支, -20保存;

試劑四:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制:臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、試劑四的配制:臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動物)25(其它物種)預(yù)熱5分鐘。

5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1 1min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2

注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.1,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定,使ΔA小于0.1可提高檢測

 

靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

PEPCK活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)PEPCK活力計算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=3215×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計算

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位定義:每1萬個細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)PEPCK活力計算

單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計算

1)按樣本蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位定義:每1萬個細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=12.86×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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