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尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/27      點擊次數(shù):394

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphosphprylase,UGP)試劑盒說明書

                                                       微量法100T/96S

 

   :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

UDPG焦磷酸化酶是生物體糖原合成過程中的關鍵。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖(UDPG)。

 

測定原理:

UGP可逆催化反應生成1磷酸葡萄糖,在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉(zhuǎn)化為NADPH,340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板

 

試劑組成和配制: 

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑五:液體2mL×1瓶,4℃保存。

 

酶液提取:

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細胞:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

3.        液體:直接檢測。

 

測定操作:

1.        紫外分光光度計/酶標儀預熱30min,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板,依次加入100μL試劑一,20μL試劑二,20μL試劑三,20μL試劑四,20μL試劑五,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm30s的吸光值A1330s的吸光值A2,△A=A2-A1

 

 

計算公式:

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

3)按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /104 cell= ΔA÷ε×d×V反總÷(V×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量

4)按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /mL)=ΔA÷ε×d×V反總÷V÷T=321.54×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.2mL;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

3)按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /104 cell= ΔA÷ε×d×V反總÷(V×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=643.08×ΔA÷細胞數(shù)量

4)按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmolNADP定義為一個酶活力單位。

UGPnmol/min /mL=ΔA÷ε×d×V反總÷V÷T=643.08×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.2mL;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mLT:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g


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