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維生素B1(Vitamin B1,VB1)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/30      點(diǎn)擊次數(shù):403

維生素B1Vitamin B1VB1)試劑盒說明書

 微量法100T/96S

 

   正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

維生素B1Vitamin B1)是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分,參與細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán),是維持機(jī)體正常代謝必須的水溶性維生素,在生物體能量代謝中有重要的作用。

 

測定原理:

VB1在堿性條件下還原鐵氰hua鉀生成亞鐵氰hua鉀,亞鐵氰hua鉀與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍(lán),在704nm有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體70mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體2mL×1支,4℃保存。

試劑三:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑四:液體5mL×1瓶,4℃保存。

試劑五:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。

 

樣本處理:

1.        組織:將樣品磨碎,按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定(動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30min。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測定。

3.        血清:直接測定。                  

 

測定操作:


空白管

測定管

樣品(μL


20

試劑一(μL

20


試劑二(μL

16

16

試劑三(μL

20

20

充分混勻,80℃反應(yīng)10min

提取液(μL

16

16

試劑四(μL

44

44

試劑五(μL

24

24

H2OμL

60

60

充分混勻,靜置20min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測定704nm處吸光值,記為A空白管和A測定管,△A=A測定管-A空白管。

 

計(jì)算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.017x+0.0031,R2 = 0.9991;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度:μg/mL;y為△AA測定管-A空白管)

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB1含量(μg/mg prot=(△A-0.0031÷ 0.017÷Cpr

                    = 58.8×(△A-0.0031÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB1含量(μg/g鮮重)=(△A-0.0031÷ 0.017÷W÷V樣總)

                = 58.8×(△A-0.0031÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB1含量(μg/104 cell=(△A-0.0031÷ 0.017÷(細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                     = 58.8×(△A-0.0031÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB1含量(μg/mL=(△A-0.0031÷ 0.017

                  = 58.8×(△A-0.0031

V樣總:加入提取液體積,1mLCpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0085x +0.0031,R2 = 0.9991;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度:μg/mL;y為△AA測定管-A空白管)

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB1含量(μg/mg prot=(△A -0.0031÷ 0.0085÷Cpr

                    = 117.65×(△A-0.0031÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB1含量(μg/g鮮重)=(△A-0.0031))÷ 0.0085÷W÷V樣總)

                = 117.65×(△A-0.0031÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB1含量(μg/104 cell=A-0.0031÷ 0.0085÷(細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                     = 117.65×(△A-0.0031÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB1含量(μg/mL=(△A-0.0031÷ 0.0085

                  = 117.65×(△A-0.0031

V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng):

1.        若測定結(jié)果中吸光值超過2,請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.        蛋白濃度較高的樣品,比如動(dòng)物組織,若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生,將樣本稀釋后再重新測定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        顯色完成后立即進(jìn)行測定。

4.        標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1-10μg/mL。


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