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維生素E(Vitamin E,VE)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/30      點(diǎn)擊次數(shù):387

維生素EVitamin E,VE)試劑盒說(shuō)明書

  微量法100T/48S

 

測(cè)定意義

維生素EVitamin E)是一種脂溶性維生素,其水解產(chǎn)物為生育酚,是生物體中最主要的抗氧化劑之一,能阻止不飽和脂肪酸收到過(guò)氧化作用的損傷,維持不飽和脂肪酸細(xì)胞膜的完整性和正常功能,具有延緩衰老、預(yù)防溶血性貧血作用,在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品行業(yè)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

 

測(cè)定原理

VE還原Fe3+Fe2+,Fe2+1,10-菲羅啉產(chǎn)生有色絡(luò)合物,在530nm有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、漩渦震蕩儀。

 

試劑組成和配制

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:液體2mL×1支,4℃保存。

試劑三:液體2mL×1支,4℃保存。

試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。

 

樣本處理

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,勻漿后用提取液定至1mL,定至在漩渦混勻儀上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測(cè)定。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min后在漩渦混勻儀上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測(cè)定。

3.        血清:取0.1mL,加0.9mL提取液,漩渦儀混勻上震蕩5min,于25℃,5000g離心10min,取上層測(cè)定。                  

 

測(cè)定操作

 


對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL

100

100

試劑一(μL

20

20

試劑二(μL


20

試劑三(μL

20


充分混勻,25℃反應(yīng)5min

試劑四(μL

60

60

充分混勻,于微量石英比色皿/96孔板,無(wú)水乙醇調(diào)零,測(cè)定530nm處吸光值,記為A對(duì)照管和A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

 

 

計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.22x + 0.0065 R2 = 0.9978

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VE含量(μg/mg prot=(△A -0.0065÷ 0.22×V反總÷V×Cpr

                    = 9.09×(△A -0.0065÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VE含量(μg/g= (△A -0.0065÷ 0.22×V反總÷V×W÷V樣總)

                    = 9.09×(△A -0.0065÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VE含量(μg/104 cell=(△A -0.0065÷ 0.22×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                    = 9.09×(△A -0.0065÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VE含量(μg/mL=(△A -0.0065÷ 0.22×V反總÷V×10

                = 90.9×(△A -0.0065

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.       96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.11x + 0.0065 R2 = 0.9978

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VE含量(μg/mg prot=(△A -0.0065÷ 0.11×V反總÷V×Cpr

                    = 18.18×(△A -0.0065÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VE含量(μg/g= (△A -0.0065÷0.11×V反總÷V×W÷V樣總)

                    = 18.18×(△A -0.0065÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VE含量(μg/104 cell=(△A -0.0065÷ 0.11×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                    = 18.18×(△A -0.0065÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VE含量(μg/mL=(△A -0.0065÷0.11×V反總÷V×10

                = 181.8×(△A -0.0065

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mLV樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mLCpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng)

若反應(yīng)體系產(chǎn)生沉淀,需要將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?,并在?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。


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