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ATP含量試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/31      點(diǎn)擊次數(shù):395

ATP含量試劑盒說明書

微量法100/48

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

ATP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是生物能量通貨,能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測定ATP含量并且計(jì)算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。

 

測定原理:

肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸,可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸含量,以此反應(yīng)ATP含量。

 

自備儀器和用品:

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

酸性提取液:液體60mL×1瓶,4保存;

堿性提取液:液體60mL×1瓶,4保存;

試劑一:粉劑×1支,4保存;臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑二:液體1.5mL×1支,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑四:液體5mL×1瓶,4保存;

試劑五:液體25mL×1瓶,4保存;

標(biāo)準(zhǔn)液:液體10mL×1瓶,2μmol/mLATP標(biāo)準(zhǔn)液,4保存;

 

ATP提取

1、血清(漿)中ATP的提?。喊凑昭澹{)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4 離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。

2、組織中ATP的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4離心10min,取上清至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎1min(冰浴,強(qiáng)度20%或200W,超聲2s,停1s),8000g 4 離心10min;取上清液至另一EP管中,加入等體積的堿性提取液使之中和,混勻,8000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測(不可用于蛋白質(zhì)含量測定)。

 

測定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到700nm,蒸餾水調(diào)零

2、顯色劑的配制:臨用前請根據(jù)擬用顯色劑體積(樣本數(shù)×0.2 m L),按試劑四(mL):試劑五(mL=15的比例配制。用多少配多少。

 

3、樣本測定:

試劑名稱(μL)

測定管

對照管

標(biāo)準(zhǔn)管

空白管

樣本

10

10



標(biāo)準(zhǔn)液



10

10

試劑一

20


20


試劑二

10

10

10

10

試劑三

10


10


蒸餾水


30


30

充分混勻,37準(zhǔn)確水浴30min

顯色劑

200

200

200

200

37水浴20min后,700nm下測定各管吸光值

注意空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對照管。

 

ATP含量計(jì)算:

1、血清(漿)中ATP含量計(jì)算

ATP含量(μmol/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1]÷(V3×V1÷V2)=40×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP含量計(jì)算

1)按蛋白濃度計(jì)算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1(V1÷Cpr=2×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

2)按樣本鮮重計(jì)算

ATP含量(μmol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1(W×V1÷V2)=4×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

ATP含量(μmol/104 cell=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ×V1(500×V1÷V2)=0.008×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)液濃度,2μmol/mLV1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;V2加入提取液體積,2mLV3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

注意:Z低檢測限為10nmol/mL10nmol/g鮮重或0.1nmol/mg prot


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