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丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/3      點(diǎn)擊次數(shù):506

丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法100/96

 

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:                                      

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸,生成過(guò)氧化脂質(zhì);后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物,其中包括MDA。通過(guò)檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。


測(cè)定原理:

MDA與硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成紅色產(chǎn)物,在532nm有最大吸收峰,進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量;同時(shí)測(cè)定600nm下的吸光度,利用532nm600nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的含量。


需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。


試劑的組成和配置:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體30mL×1瓶,4保存;

注意事項(xiàng):

臨用前注意試劑一是否wan全溶解,如未溶解,可以70-90加熱,并振蕩以促進(jìn)溶解。

 

MDA提取:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、吸取0.3mL 試劑一1.5mL離心管中,再加入0.1mL樣本, 混勻。

2、95水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g25℃,離心10min。

3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,測(cè)定532nm600nm處的吸光度,記為A532A600,ΔA= A532-A600。

 

MDA含量計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)中MDA含量的計(jì)算:

MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V=25.8×ΔA

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中MDA含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V)=25.8× ΔA ÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109(W ×V÷V樣總)=25.8×ΔA ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109(500×V÷V樣總)=0.0516×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積, 4×10-4 Lε:丙二醛摩爾消光系數(shù),155×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)中MDA含量的計(jì)算:

MDA含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V=51.6×ΔA

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中MDA含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

MDA含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V)=51.6×ΔA÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109(W ×V÷V樣總)=51.6×ΔA÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)×109(500×V÷V樣總)=0.1032×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,4×10-4 L;ε:丙二醛摩爾消光系數(shù),155×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.1 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。


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