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單寧酶(Tannase,TAN)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/11/6      點擊次數(shù):444

單寧酶(TannaseTAN試劑盒說明書

                                       微量法100/48

 

 

   意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20),它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,生成沒食子酸和葡萄糖。

 

測定原理

使用抗氧化劑沒食子酸丙酯(PG)作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物,在270nn下測定底物PG反應(yīng)前后的光密度變化,計算單寧酶酶活力。

 

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96UV、研缽、冰、蒸餾水

 

試劑的組成和配制

試劑一:液體100mL×2瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1支,4℃保存;臨用前每支加入6mL試劑一,充分溶解后備用;用不完的試劑4℃保存;

 

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

液體樣本:直接取上清測定。

 

測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到270 nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

試劑名稱(μL

對照管

測定管

95℃水浴5min后滅活的粗酶液

50


粗酶液


50

試劑二

50

50

混勻,40℃準(zhǔn)確保溫10 min后,置95℃水浴中10 min(蓋緊,防止水分散失),冷卻

試劑一

900

900

混勻,取200uL至微量石英比色皿或96UV板中,270nm處讀取各管吸光值。計算ΔA=A對照-A測定。每個測定管需設(shè)個一個對照管。

 

注意:

 

1.可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進行5min 95℃沸水浴處理。

2.務(wù)必使用96UV板(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測波長小于340nm務(wù)必使用UV板)。

 

TAN活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044,R2 = 0.9994;xPG含量(µmol/L),y為吸光值。

1、按樣本體積計算

單位的定義:40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V÷T

=34.48×( ΔA-0.0044

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義:40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)

TAN活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044÷Cpr

3、按照樣本鮮重計算

單位的定義:40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V÷V樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,10min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044,R2 = 0.9994;xPG含量(µmol/L),y為吸光值。

1、按樣本體積計算

單位的定義:40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V÷T

=68.97×( ΔA-0.0044

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義:40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)

TAN活性(µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V×Cpr)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044÷Cpr

3、按照樣本鮮重計算

單位的定義:40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個酶活單位(U)

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V÷V樣總×W)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,10min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g。


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