【產品名稱】

商品名稱：乙型流感病毒（IBV）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Influenza B virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

乙型流感，是由乙(B)型流感病毒引起的流行性感冒，其特點是起病急驟，畏寒、發(fā)熱，體溫在數小時至 24 小時內升達高峰，39-40℃甚至更高。伴頭痛，全身酸痛， 乏力，食欲減退。呼吸道癥狀較輕，咽干喉痛，干咳，可有腹瀉。顏面潮紅，眼結膜外眥充血，咽部充血，軟腭上有濾泡

本試劑盒適用于檢測的咽拭子、血清和痰等標本中乙型流感病毒 RNA，適用于乙型流感病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對乙型流感病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對乙型流感病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于科研上對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

名稱規(guī)格

酶液50μL×1 管

IBV 反應液1.0mL×1 管

IBV 陽性質控品50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

咽拭子：應使用與用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部； 迅 速將拭 子放入 標本采集 管中， 旋 緊管蓋 并密封， 以防干 燥。全血：疑似感染病人的靜脈血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管，8000rpm 離心 2min，取適量上清液于 1.5mL 滅菌離心管中。痰： 以清晨的第一口痰為宜。先用清水漱口， 囑患者用力咳出深部的痰于無菌樣本保存管，密封，即可送檢。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取適量樣本于 1.5mL 滅菌離心管中，按 RNA 提取試劑盒說明書進行提取。

1.2RNA 提取

推薦采用公司生產的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑IBV 反應液酶液

用量20μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數設置：

步驟循環(huán)數溫度時間收集熒光信號

11 cycle42℃20min否

21 cycle95℃10min否

340 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6.檢測方法的局限性

6.1樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

6.2樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

6.3陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

6.4病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

6.5不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.6試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

6.7本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。