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乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/9/19      點擊次數(shù):372

乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)試劑盒說明書

                                                微量法100T/96S

 

注    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.1)是植物光呼吸代謝中的關鍵酶,也是光下合成草酸的關鍵酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,對研究光呼吸代謝過程及其調(diào)控具有重要意義。

 

測定原理:

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和鹽酸苯肼反應生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加5mL雙蒸水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:液體2mL×1支,4℃保存。

 

酶液提?。?/p>

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g, 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定操作表:

 


測定管

樣本(μL)

10

試劑一(μL)

130

試劑二(μL)

40

試劑三(μL)

20

充分混勻,立即于微量石英比色皿/96孔板中測定324nm處10s和190s吸光值A1和A2,△A=A2- A1

 

酶活性計算公式:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。

GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 392×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。

GO活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 392×△A÷W

ε:乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù):17L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:反應中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應時間,3min

 

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。

GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 784×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克組織每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。

GO活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 784×△A÷W

ε:乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù):17L/mmol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應總體積,0.2mL;V樣:反應中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應時間,3min



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