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土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(S-NAG)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/9/20      點(diǎn)擊次數(shù):395

土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(Solid-N-acetyl-β-D-glucosidase, S-NAG試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法100/48

 

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:                           

S-NAG是溶酶體中的一種酸性水解酶,由土壤微生物分泌。S-NAG活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。

 

測(cè)定原理:

S-NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算NAG活性。

 

自備用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、甲苯(不允許快遞)和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:甲苯5mL×1瓶,4保存;(自備)

試劑二:粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20保存;

試劑三:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑四:液體15mL×1瓶,4保存;

 

樣品處理

新鮮土樣自然風(fēng)干或37度烘箱風(fēng)干,過(guò)30~50目篩。

 

測(cè)定步驟:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  加樣表

試劑名稱

測(cè)定管

對(duì)照管

風(fēng)干土樣(g

0.02

0.02

試劑一(μL

10

10


室溫振蕩混勻15min

90℃振蕩混勻15min

試劑二(μL

130


蒸餾水


130

試劑三(μL

160

160

混勻, 37振蕩反應(yīng)1h90水浴5min(蓋緊,防止水分散失),流水冷卻,

10000g 25離心10min,取上清液(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

上清液μL

70

70

試劑四μL

130

130

充分混勻,室溫靜置2min后, 400nm處測(cè)定吸光值A,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

S-NAG活力計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.00645x -0.0054;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/L),y為吸光值。

單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

S-NAG活力(μmol/d/g 土樣)= (ΔA+0.0054) ÷0.00645×V反總÷W÷T =55.81×(ΔA+0.0054)

T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d; V反總:反應(yīng)體系總體積:3×10-4 L;W:樣本質(zhì)量,0.02g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0043x -0.0054x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/L),y為吸光值。

單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

S-NAG活力(μmol/d/g 土樣)= (ΔA+0.0054) ÷0.0043×V反總÷W÷T =83.72×(ΔA+0.0054)

T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d; V反總:反應(yīng)體系總體積:3×10-4 L;W:樣本質(zhì)量,0.02g。



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