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氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/16      點(diǎn)擊次數(shù):398

氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒說明書

                                              微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

GSH/GSSG是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對(duì)之一。因此,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSHGSSG含量以及GSH/GSSG比值,能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài),也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標(biāo)之一。

 

測(cè)定原理:

利用2-VP法測(cè)GSSG含量。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體600μL×1支,4保存。

試劑三:液體50mL×1瓶,4保存。

試劑四:液體2.5mL×1瓶,4保存。

試劑五: 液體15μL×1瓶,-20保存。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋,4保存。

試劑六:粉劑×1瓶,4保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

粗酶液提取:

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);8000g 4離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)混勻待測(cè)。

3. 血清等液體:直接測(cè)定。

 

GSSG含量測(cè)定:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中保溫30min。

3.1 mL EP管,加入100μ L上清液,5 μ L試劑二,蓋緊后混勻,得混合液,置于37水浴30min;取21μ L混合液于96孔板,然后依次加入20 μ L試劑四、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六,迅速混勻后,測(cè)定30 s150 s光吸收A1A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。

 

GSSG含量計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。

 

2、 按蛋白濃度計(jì)算

GSSGnmol/mg prot=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V×Cpr)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

GSSGnmol /g 鮮重=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V÷V樣總×W)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSSGnmol/104 cell=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=36.23×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計(jì)算

GSSGnmol/mL=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V÷V

=36.23×(ΔA+0.0011)

V樣:反應(yīng)中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr樣本蛋白濃度(mg/mL

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計(jì)算

GSSGnmol/mg prot=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V×Cpr)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

GSSGnmol /g 鮮重=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V÷V樣總×W)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSSGnmol/104 cell=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=72.46×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計(jì)算

GSSGnmol/mL=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V÷V

=72.46×(ΔA+0.0011)

V樣:反應(yīng)中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr樣本蛋白濃度(mg/mL

 

注意事項(xiàng):

1.        提取過程中去掉蛋白質(zhì),所以提取液不能用于測(cè)定蛋白含量。

2.        臨用前配制的試劑配好后4℃保存,2天內(nèi)使用完畢。

3.        Z低檢出限為0.1μmol/L

4.  反應(yīng)溫度嚴(yán)格來說,為保證重復(fù)性,應(yīng)在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。

5.   反應(yīng)時(shí)間需精確控制,否則會(huì)影響反應(yīng)速率計(jì)算,產(chǎn)生較大誤差。

6.   樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,否則反應(yīng)速率太大,沒法控制,所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。


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