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谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/16      點擊次數(shù):409

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶glutathione S-transferase,GST試劑盒說明書

                                              微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,主要催化各種化學物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價結(jié)合,使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),易于從膽汁或尿液中排泄,達到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的。因此,GST在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學功能。此外,因為GST具有GSH-Px活性,亦稱為non-Se GSH-Px,具有修復氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的功能。注意,GST催化的反應減少GSH含量,但是不增加GSSG含量。

 

測定原理:

GST催化GSHCDNB結(jié)合,其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm;通過測定340nm波長處吸光度上升速率,即可計算出GST活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體22mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加2 mL蒸餾水溶解。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.  血清等液體:直接測定。

測定:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三放在25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)保溫。

3. 測定管:取微量石英比色皿或96孔板,加入20μL上清液,180μL試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于340nm測定吸光度變化,記錄10 s310 s吸光度為A1A2。

 

GST活性計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

 

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/mg prot=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V)÷T

=230×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/g 鮮重=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1)÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/104 cell=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=230×(A2-A1) ÷細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/mL=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V÷T

                   = 230×(A2-A1)

ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103 L/mol /cm;d:比色皿光徑,1cm1061mol=1×106μmol;V反總:反應體系總體積,220μL=2.2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),5min

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/mg prot=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(Cpr×V)÷T

=460×(A2-A1) ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每克樣品每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/g 鮮重=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/104 cell=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=460×(A2-A1)÷細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol/L CDNBGSH結(jié)合為1個酶活單位。

GSTnmol/min/mL=(A2-A1)÷ε÷d×109×V反總÷V÷T

                   =460×(A2-A1)

ε:產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),9.6×103 L/mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;1061mol=1×106μmolV反總:反應體系總體積,220μL=2.2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V

 

樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),5min。

 

注意事項:

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進行,且須在當日測定酶活力;

2. 細胞中GST活性測定時,細胞數(shù)目須在300-500萬之間,細胞中GST的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞;

3. 本法測定GST活性的線性范圍可達76 μmol/min /L,測定前先用12個樣做預實驗,如5min內(nèi)反應不成線性,須對樣品用蒸餾水稀釋,計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù);

4. 測定反映的溫度對測定結(jié)果有影響,請控制在25℃或者37℃(哺乳動物)。


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