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γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/16      點擊次數(shù):384

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶γ-GT試劑盒說明書

                                          微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

γ-GTγ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?;衔锷系?/span>γ-谷氨?;D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨?;衔锏乃?,產(chǎn)生谷氨酸鹽,在細胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

 

測定原理:

γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸,生成對硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通過測定405nm光吸收增加速率,來計算γ-GT酶活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體4mL×1瓶,4℃保存。

試劑四:液體14.8mL×1瓶,4℃保存。

工作液(在試劑二瓶中配制):臨用前配制,把試劑三倒入試劑二瓶中,充分溶解(室溫過低時可以40℃水浴促進溶解);然后把試劑四倒入試劑二瓶中,混勻后室溫保存。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g4離心15min,取上清,置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4,離心15min,取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體:直接測定。

 

γ-GT測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,調(diào)節(jié)波長到405 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中預熱30min(保證無沉淀)。

3. 測定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,依次加入20μL上清液,180μL工作液,混勻后于405nm測定10s70s時吸光度,記為A1A2。

 

γ-GT活性計算:

標準曲線:y=0.006x+0.0016,x為對硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。

 

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/mg prot=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/g 鮮重=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:25或者37中,每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/104 cell=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/mL= [ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷V÷T

= 1.67 × [ (A2A1)0.0016]

V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4LCpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:反應體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),1min

b.使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線:y=0.003x+0.0016,x為對硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。

 (1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/mg prot=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=3.34× [ (A2A1)0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/g 鮮重=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2A1)0.0016] ÷W

3)按細胞數(shù)量計算

活性單位定義:25或者37中,每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/104 cell=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷(細胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2A1)0.0016] ÷細胞數(shù)量

4)按液體體積計算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GTμmol/min/mL= [ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷V÷T

= 3.34 × [ (A2A1)0.0016]

V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量,g;V樣:反應體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mLT:反應時間(min),1min。

 

注意事項:

1.        培養(yǎng)細胞中γ-GT活性測定時,細胞數(shù)目須在300-500萬之間,細胞中γ-GT的提取時可加試劑一后

 

2.        研磨或超聲波處理,不能用細胞裂解液處理細胞(防止因為蛋白質(zhì)變性導致酶失活)。

3.        配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。


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