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硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/16      點(diǎn)擊次數(shù):389

硫氧還蛋白過氧化物酶TPX活性測定試劑盒說明書

                                                 微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

TPX屬于過氧化物酶家族,在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實(shí)現(xiàn)抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi),如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌,在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。

 

測定原理:

TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2的吸收波長為240nm,通過測定240nm吸光度的下降速率,即可計(jì)算出TPX活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,- 20℃保存。

試劑三:液體2mL×1支,4℃。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

TPX測定操作:

取微量石英比色皿或96孔板,加入4 μL上清液,180 μL試劑二,16 μL試劑三,迅速混勻后于240 nm測定10s130s吸光度,記為A1A2。

 

TPX活性計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPXnmol/min /mg prot=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷Cpr×V樣)÷T

 

=573×(A1A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min/g 鮮重=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=573×(A1A2)÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min/104 cell=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=573×(A1A2)÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mL=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷V÷T

=573×(A1A2)

εH2O2的摩爾消光系數(shù),43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200 μ L=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),4 μL=4×10-3 mLV樣總:提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間(min),2min。

 

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mg prot=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=1146×(A1A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min/g 鮮重=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=1146×(A1A2)÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min/104 cell=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=1146×(A1A2)÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性(nmol/min /mL=(A1A2)÷ε÷d×V反總÷V÷T

=1146×(A1A2)

εH2O2的摩爾消光系數(shù),43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d96孔板光徑,0.5cmV反總:反應(yīng)體系總體積(L),200 μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),4 μ L=4×10-3 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),2min。


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