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抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/10/29      點(diǎn)擊次數(shù):396

抗壞血酸氧化酶ascorbate oxidase,AAO活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                    微量法100T/96S

 

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

AAO是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白,屬藍(lán)銅氧化酶"家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO與細(xì)胞壁的代謝和生長(zhǎng)有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過(guò)質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b還原,該過(guò)程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

 

測(cè)定原理:

AAO可直接氧化AsA,通過(guò)測(cè)定AsA的氧化量,可計(jì)算得AAO活力。

 

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備:

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。

 

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g,4離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

 

AAO測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265 nm。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預(yù)熱的試劑二和10μL試劑三,迅速混勻后在265nm測(cè)定10s130s光吸收A1A2,A =A1-A2

 

AAO活性計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

= 92.4×A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

 

AAO(nmol/min/g 鮮重) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 92.4×A÷W

εAsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cm;d:比色皿光徑(cm),1 cm V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;1061mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;

T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位

AAO(nmol/min /mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

=184.8×A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

= 184.8×A÷W

εAsA265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol/cm;d96孔板光徑(cm),0.5 cm; V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;1061mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;

T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。

 

注意事項(xiàng):

配制好的試劑放在4℃保存,三天內(nèi)使用完。


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