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抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/29      點(diǎn)擊次數(shù):406

抗壞血酸過氧化物酶APX活性測定試劑盒說明書

                                               微量法100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX具有多種同功酶,分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過氧化物和乙醛酸體,以及過氧化體和類囊體膜上。APX 催化H2O2氧化AsA,是植 AsA 的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量,APXAsA具有一定的負(fù)相關(guān)性。

 

測定原理:

APX 催化H2O2氧化AsA,通過測定AsA氧化速率,來計(jì)算得APX活性。

 

自備儀器用品:

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加3 mL蒸餾水充分溶解。

試劑三:液體3mL×1支,4℃保存。

 

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。13000g,4離心20min,取上清置冰上待測。

 

測定:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到290nm,用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃中預(yù)熱30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL預(yù)熱的試劑一20μL試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后在290nm測定10s130s光吸收A1A2,A=A1-A2

 

APX活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

=1786×A÷ Cpr

2按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重 ) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

 

=1786×A ÷W

εAsA290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑(cm),1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;1091mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。

 

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1)  按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/mg prot) = A÷(ε×d×V反總×109÷(Cpr×V)÷T

=3571×A÷ Cpr

2按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:每g組織每分鐘氧化1nmol AsA 1個(gè)酶活單位。

APX(nmol/min/g 鮮重) = A÷(ε×d×V反總×109÷(W×V÷V樣總)÷T

=3571×A ÷W

εAsA290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×103 L/mol/cmd96孔板光徑(cm),0.5 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4 L1091mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積(mL),20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),2min。

 

注意事項(xiàng):

配制好的試劑二4℃保存,并且3天內(nèi)使用完。


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