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偷死野田村病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

簡要描述:偷死野田村病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus,CMNV)是一種RNA病毒,主要感染對蝦,常出現(xiàn)蝦頭發(fā)黑死亡,會通過水質(zhì)橫向傳播,對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大,因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。

  • 更新時間:2024-07-17
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 生產(chǎn)地址:上海
  • 訪  問  量:366

詳細介紹

品牌YLKBIO貨號YLK10369P
規(guī)格50T供貨周期現(xiàn)貨
主要用途科研實驗應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè)
英文名稱Covert Mortality Nodavirus(CMNV) SYBR qRT-PCR Kit保存條件低溫運輸,-20℃保存
有效期12個月試劑盒說明不同批號的試劑盒組分不可交互使用

偷死野田村病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒


商品名稱:偷死野田村病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Name     :Covert Mortality Nodavirus(CMNV) SYBR qRT-PCR Kit

偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus,CMNV)是一種RNA病毒,主要感染對蝦,常出現(xiàn)蝦頭發(fā)黑死亡,會通過水質(zhì)橫向傳播,對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大,因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點:

1. 一站式,用于不需要單獨準備每種成分,包括引物和對照。

2.根據(jù)偷死野田村病毒的保守基因序列設(shè)計的引物,具有良好的特異性。

3.基于染料法qRT-PCR檢測,靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,可以達到至少1000拷貝/反應(yīng)。

4.使用一管式qRT-PCR技術(shù),RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。

5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。

【試劑組成】

 

十孔盒包裝

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

100 μL(紅蓋)

 ROX染料I

50 μL(棕色管)

ROX染料II

50   μL(棕色管)

熒光PCR專用模板稀釋液

1mL(亮黃蓋)

偷死野田村病毒RT-PCR引物混合液

100   μL(白蓋)

偷死野田村病毒RT-PCR陽性對照

1×10E8拷貝/μL

50   μL(黃蓋)

核酸釋放劑試用裝

20次(1mL,綠蓋)

使用手冊

1

【儲存條件及有效期】

低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供RNA片段作為陽性對照。


【自備試劑】樣品RNA


【使用方法】

一、稀釋陽性對照(以10E2-10E7610倍稀釋度為例。由于標(biāo)準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。

1.       標(biāo)記6個離心管,分別為76,5,43,2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。

2.      7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

3.      換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

4.      換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

5.       如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?span>10μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL10μL相當(dāng)于1萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)??梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6.      用自選方法純化N+2個樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進行)

如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于標(biāo)準曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4PCR

7.       管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(用第4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個,其余不變。

8.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):

成分

N+2個制備所得樣品

RT-PCR陰性對照

RT-PCR陽性

對照(2-7管)

2×qRT-PCR 緩沖液

10μL

10μL

10μL

口蹄疫病毒RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

0.4μL

 樣品制備所得RNA模板(來于第8步)

5.6μL

不加

不加

稀釋所得6個陽性對照(來于第6步)

不加

不加

5.6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

:需使用ROX染料I的機型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的機型::ABI Prism 7500、7500Fast、MJ ResearchChromo4、OpticonIICorbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機型:Thermal Cycle Dice Real Time System, LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000RotorGene 6000。

9.       上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。


過程

溫度

時間

RT(逆轉(zhuǎn)錄)

50℃

15-30分鐘

預(yù)變性

94℃

2分鐘

RT - PCR反應(yīng)

30個循環(huán))

95℃

15

60

15 秒(采集FAM通道的熒光信號)

72

15

按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析








四、數(shù)據(jù)處理

10.       如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,再推算出其濃度。

11.       如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。

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