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偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

簡要描述:偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV) 會引起偽狂犬病,病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異。

  • 更新時間:2024-07-17
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 生產(chǎn)地址:上海
  • 訪  問  量:448

詳細介紹

品牌YLKBIO貨號YLK10371P
規(guī)格50T供貨周期現(xiàn)貨
主要用途科研實驗應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè)
英文名稱Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit保存條件低溫運輸,-20℃保存
有效期12個月試劑盒說明不同批號的試劑盒組分不可交互使用

偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒


商品名稱:偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     :Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit

偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV) 會引起偽狂犬病,病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異:哺乳仔豬最為敏感,15日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型,主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運動不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運動,最后昏迷死亡;育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高,呼吸困難,一般不發(fā)生死亡,耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒;成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高,一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期,可在感染后的20天左右發(fā)生流產(chǎn),在妊娠后期,經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊,或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū),偽狂犬病被認為是對經(jīng)濟影響最大的豬病毒病,因此偽狂犬病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒,

它具有下列特點:

1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)偽狂犬病病毒保守序列設(shè)計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量PCR檢測,避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。


【試劑組成】

成分

十孔盒包裝

2×qPCR MagicMix

500μL(棕色管)

熒光PCR專用模板稀釋液

1 mL(黃蓋)

偽狂犬病病毒PCR引物混合物

100μL(白蓋)

偽狂犬病病毒PCR陽性對照

(10E8 拷貝/μL)

50μL(紅蓋)

DNA病毒裂解液(試用裝)

15次(9 mL

使用手冊

1

【儲存條件及有效期】

低溫運輸、-20℃保存,有效期一年。


【自備試劑】DNA模板、10×ROX(根據(jù)機型決定,具體見使用方法)。


【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL610倍稀釋度為例)

1.       注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2.      標(biāo)記6個離心管,分別為7,65,4,32。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。

4.      7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5.      換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6.      換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7.      重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

樣品DNA的制備

8.       如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PCNC的體積也必須是200μL

9.      用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20 μL體系,在樣品制備室進行)

如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對

10.       照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加23倍。

11.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

成分

樣品管

N+2

PCR陰性對照管

PCR陽性

對照管(2-7管)

2×qPCR MagicMix

(棕色管)

10 μL

10 μL

10 μL

偽狂犬病病毒PCR

引物混合液(白蓋)

2 μL

2 μL

2 μL

自備10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

2 μL

 N+2待測樣品DNA模板

6 μL

不加

不加

7步所得PCR陽性對照

稀釋液(2-7號)

不加

不加

6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

:ABI7500、77007900儀器需要使用ROX作為對照,其他熒光PCR儀器(如iCycler IQMJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000RotorGene 3000、RotorGene 6000LightCycler480)不需要使用ROX,則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。

過程

溫度

時間

預(yù)變性

92℃

5分鐘

PCR反應(yīng)

30個循環(huán))

92℃

60

58

60

74

60

13.      數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時,最大吸收光譜在471 nm,結(jié)合DNA時的最大吸收光譜在500 nm,最大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14.      如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。

       15.     如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。

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